工艺开发的细胞库管理

蓝调 2021-01-05 AM 2162℃ 0条

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病毒载体/抗体的制备需要一个稳定、连续的生产工艺,细胞库具有良好的均质性,且经过充分的质量鉴定,从而最大限度地控制污染风险,可以为研发生产提供质量相同、遗传稳定的细胞来源,以确保研发注册阶段病毒载体生产的稳定性和可靠性。
研发过程中频繁用到各类细胞,但是并不是所有的细胞都需要建库并按照细胞库管理。只有那些需要建库用于检测或者后续用于生产的细胞才需要按照细胞库的管理要求进行管理。
Q:PBMC如何管理(原材料)-基因与细胞治疗研发物料的管理

1细胞库的三级管理

细胞库分为三级管理,即初级/原始细胞库、主细胞库和工作细胞库。如为引进的细胞,可采用主细胞库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些特殊情况下,也可采用细胞种子和主细胞库二级管理,但需要得到国务院药品监督部门的批准。

1.1初级细胞库(pre-master cell bank)

又名细胞种子(cell seed)和原始细胞库 (Primary Cell Bank,PCB), 由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体,或经过克隆培养形成的均一细胞群体,通过检定证明(具体检定项目要求见表1和表2)适用于生物制品生产或检定。在特殊条件下,将一定数量、成分均一的细胞悬液,定量均匀分装于安瓿或适宜的细胞冻存管,于液氮冻存,即为原始细胞库,供建立主细胞库用。

1.2主细胞库(Master Cell Bank,MCB)

原始细胞库细胞传代增殖后均匀混合成一批,定量分装,保存于液氮或-130℃以下。这些细胞须按其特定的质控要求进行全面检定((具体检定项目要求见表1和表2)),全部合格后即为主细胞库,供建立工作细胞库用。主细胞库的质量标准应高于初级细胞库。生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。

1.3工作细胞库(Working Cell Bank,WCB)

经主细胞库细胞传代增殖,达到一定代次水平的细胞,合并后制成一批均质细胞悬液,定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管,保存于液氮或一130°C以下备用,即为工作细胞库。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产的最高限定代次,最高限定代次应根据研究结果确定,不得超过国际认可的最高限定代次。工作细胞库的质量标准应在主细胞库的质量标准基础上建立。生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。

2细胞库构建

原始细胞库一般由研发构建,用于主细胞库的构建。
主细胞库和工作细胞库应在B级背景下的A级洁净等级下分离或制备后获得,建库过程中操作人员不得在同一区域同时处理不同活性或具有传染性的物料,如病毒、细胞系、细胞株。
建立每个细胞库均应有相应的建库记录,记录细胞来源,何时复苏,传代具体信息,何时冻存,冻存细胞批号,冻存的细胞代次,冻存数量。每个库的细胞冻存后,应抽取其中可代表冻存全过程的细胞进行复苏,检查有无染菌,复苏后细胞活力应大于80%。

3细胞库的管理要求

  1. 细胞接收应当保留相应的证明文件(营业执照/合同/发票/背景资料(来源和培养历史)/COA/报关单/操作手册等),未检测和经过检验的细胞应该分开存放,防止交叉污染。接收过程中应当检查送货单与采购订单信息是否一致,细胞的标识是否清晰完整,包装物信息与供应商提供的质量文件是否一致,运输温度是否满足要求。
  2. 应当详细记录细胞建库的过程,包括细胞建库过程中使用的所有原材料,以及细胞传代和冻存的过程。
  3. 冻存的细胞存活率须在90%以上(特殊细胞视具体情况而定)。冻存后的细胞,应至少做一次复苏培养并连续传代至衰老期,检查不同传代水平的细胞生长情况。
  4. 在指定人员的监督下,经批准的人员方可进行细胞库操作,未经批准不得接触细胞库。需要双人双锁管理,出入应当经过适当的流程批准。
  5. 贮藏容器应当在适当温度下保存,并有明确标签,冷藏库应有连续温度记录(液氮不需要),应定期检查液氮罐内液氮量并及时补加,液氮保藏区温湿度、大气压、氧分压、电力供应这些指标应做好记录,任何偏离贮存条件的情况及纠正措施都应记录。市场上有很多智能化控制的液氮罐,有助于细胞存储环境的实时监控等,提高工作效率和安全性。存储容器应当有使用和维护记录。
  6. 每种细胞库均应分别建立台账,记录放置位置、容器编号、贮存数量和取用记录,确保储存细胞在储存期间能被准确找到。(研发也一样,每个细胞库应当有独立的台账,方便查找。可建立细胞冻存位置图,细胞出入台账)
  7. 贮存期间的主细胞库和工作细胞库中的细胞一旦取出,不得再返回库内贮存。
  8. 主细胞库和工作细胞库贮存条件应当一致,检定和生产用各级细胞库应分不同液氮罐贮藏,且生产用每一个库应 在生产设施内至少2个不同地点或室或有明显标志分隔的区域存放(异地备份)
  9. <font color=red>非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。</font>
  10. 细胞的标签一般应包含 (细胞名称/细胞代次/活率/批号/冻存日期/瓶号等信息)
  11. 检定用细胞(非生产)如果用量较少,可以只建立单一主细胞库。但是为了保证检测结果的准确性,限定从主库中取出的细胞最高传代20代。

4细胞库的检验

<html lang="en">
<center><font color=red> <font size= 4>各类细胞的检验</font></font></center>
</html>

各类细胞的检测

<center><font color=red> <font size= 4>细胞库检测项目</font></font></center>

细胞库检测项目
细胞检定一般包含以下几个方面:鉴别、外源因子污染、内源因子、致瘤性检测等。建立细胞库的实验室应至少进行一次MCB细胞的全面检定,检定应包括:细胞鉴别试验,细菌、真菌检查,支原体检查,外源病毒因子检查等。每次建立WCB后,均应按规定项目进行检定。

4.1细胞鉴别

细胞鉴别试验方法有多种,包括细胞遗传检测(如特征染色体标志)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性抗血清)和生物化学鉴别法(如同工酶试验)等。
可选其中一种或几种方法,但均须经国家药品检定机构认可。细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断,更有利于细胞鉴别。

4.2细菌、真菌检查(无菌检查)

取细胞培养上清液样品进行检查

4.3支原体检查

取细胞培养上清液样品进行检查,应为阴性

4.4细胞內、外源病毒因子检查

外源病毒污染检查:
采用《中国药典》(三部)通则“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”中“体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子”项及“动物和鸡胚体内接种法检测外源病毒因子”项检查,应无外源病毒污染。

<font color= red><font size =4><center>内/外源病毒污染检查
项目分类 检测项目 服务说明 项目分类
体外法 细胞形态观察及血吸附试验 牛源病毒检测 CPE、血吸附试验、免疫荧光
体外不同细胞接种培养法 检测病毒:BVDV、PI3、BAV-3、REO-3、BPV
体内接种法 鸡胚、成年小鼠、乳鼠、豚鼠、家兔 猪源病毒检测 猪细小病毒
逆转录病毒检测 逆转录酶活性、透射电镜法、感染性试验、PCR法或其他特异性体外法 其他特异种属病毒检测-鼠源 检测病毒:MVM, Hantavirus, Reovirus, LCM, Sendai virus, Ectromelia virus, Adenovirus, Mouse Pneumonia Virus, MLV
其他特异种属病毒检测-人源 检测病毒:EB, HCMV, HIV-1/-2, HTLV-1/-2, HAV, HBV, HCV, B19, HHV-6/-7/-8, HSV-1/-2

4.5致瘤性检查

致瘤性(Oncogenicity)检查是保证在细胞里不存在可以使细胞永生化或者具有形成肿瘤的因子(间接作用,非细胞本身成瘤)

检测项目考虑要点
致瘤性检查新型细胞基质,特别是成瘤性为阳性的细胞,用于疫苗生产时,需检测致瘤性。
以下细胞不要求进行致瘤性检查:
CHO、NS0、Sp2/0、低代次Vero细胞
MRC-5、2BS、KMB17、WI38及FRhL-2细胞

4.6其他

成瘤性(Tumourigencity)检查:是看这个细胞机制在动物体内是否能形成肿瘤,是对细胞特性的一个鉴定。检测过程中所用的阳性对照细胞应具有成瘤性。

检测项目考虑要点
成瘤性检查
新建细胞系/株应进行成瘤性检查;
已证明具有成瘤性的传代细胞不再做成瘤性检查,如:BHK21、CHO、HEK293、C127、NS0、杂交瘤细胞等

注:成瘤性和致瘤性的区别是致瘤性是细胞内存在某些因子间接使细胞形成肿瘤,而成瘤性是细胞本生的特性。虽然成瘤性高的细胞沉淀中DNA的致瘤性高于非成瘤性细胞来源的DNA,但是关于细胞的成瘤性和其DNA的致瘤性之间的关系还不得而知。
病毒敏感性检查:用于检测活疫苗制品病毒滴度的细胞,应进行此项检查,证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感度。
细胞功能检查:用于生物学活性、效力或者效价测定的细胞,应进行此项检查,证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。

检定用细胞至少进行4.1-4.3项目的检查

参考文献:
[1]中国药典2020
[2]USP 1042 cell banking
[3]ICH Q5D
[4]钟鼎生物 https://www.zoonbio.com/protein/cell-bank-testing-service.html ; https://www.zoonbio.com/protein/cell-bank-method.html

标签: 细胞治疗, 细胞库

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