Car-T工艺开发专题1-质粒工艺开发

蓝调 2020-12-28 AM 1148℃ 0条

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1.1质粒的开发流程

种子制备(菌种库)-发酵-菌体收获-碱裂解-澄清(过滤或者离心)-超滤浓缩(提高质粒浓度)-层析(阴离子)-层析(疏水)-浓缩-除菌-灌装
质粒工艺开发流程

1.2 质粒上游发酵工艺

发酵工艺每个公司大同小异,在此就不讨论。主要的内容包括:菌种构建/筛选;RCB生产曲线,传代稳定性(还有啥?非专业请补充)

1.3质粒下游纯化工艺

其中纯化工艺有两种,GE工艺和BIA工艺。
GE工艺,进行了三次层析,包含:

凝胶过滤层析-目的去除宿主残留
疏水层析-提高超螺旋质粒含量纯度
阴离子交换层析-去除内毒素

BIA工艺,进行两次层析,包含:

阴离子交换层析-去除内毒素和RNA
疏水层析-提高质粒纯度含量

BIA工艺的阴离子交换可以同时去除内毒素和宿主残留RNA,但是RNA清除效果不如GE工艺的三次层析。

1.4 质粒的质量控制

工艺开发阶段的质粒质量控制检项如下

检测类别检测项目(PD同GMP)
常规外观
常规pH(临床前研究无)
纯度A260/A280比例
纯度质粒DNA浓度
纯度超螺旋百分比
纯度残留宿主蛋白(临床前研究无相关检项)
纯度残留宿主DNA
纯度残留宿主RNA
外源污染内毒素试验< 10EU/mg
外源污染无菌试验(临床前研究无)
质粒检定限制性酶切
质粒检定测序

1.5菌种库的管理

研发过程中需要进行管理的菌种类型包含:

感受态细胞;克隆菌种;PCB;客户菌种

PCB的管理要求是最高的,生产用的WCB来源于PCB。

1.5.1菌种的接收

  1. 接收过程中检查包装外观是否完整,送货单随货文件是否齐全;
  2. 记录接收日期,如有温度监控,温度监控记录(或接收时温度)应当记录/保存;
  3. 接收时注意核对标签信息与送货单是否一致;
  4. 接收过程中发现异常应当及时与供应商沟通,必要时应当拒签。

1.5.2菌种的保存

  1. 未检测和检测合格的应该分区存放;
  2. 存放于超低温冰箱,如有条件可以双人双锁(对于PCB),MCB和WCB必须双人双锁;
  3. 专人管理;
  4. 温度监控;
  5. 菌种的存取应当有相应的记录。

1.5.3菌种的销毁(PCB)

  1. 以下一些情况,可以考虑菌种的销毁

存储不当;
超过效期;
无保存价值。

  1. 销毁应当经过审批,如为客户菌种,还需要客户签字同意
  2. 菌种销毁应当灭活处理,121℃,40min或其他彻底灭活条件。

1.5.4菌种库的质量控制

一般需要进行以下检测

检测项 一般标准
MCB/WCB甘油菌菌库菌体活率> 1.0×107CFU/mL
MCB/WCB甘油菌菌库细菌和真菌阴性
MCB/WCB甘油菌菌库革兰氏染色革兰氏阴性菌,红色短杆状
MCB/WCB甘油菌菌库噬菌体检测阴性
MCB/WCB甘油菌菌库纯度检测TAS、SDA平板无其他杂菌生长
稳定性试验 质粒质粒产量变异系数≤ 25%
稳定性试验 质粒质粒保有率≥ 80%
稳定性试验 质粒酶切片段大小应与理论相符
稳定性试验 质粒全序列测序序列与理论相符
稳定性试验 质粒超螺旋含量> 90%

标签: 细胞治疗

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